Influence des propriétés des différents graphènes

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 13408 (2022) Citer cet article

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Les composites de nanomatériaux à base de polymère et de graphène (GBN) combinent un traitement facile sur des géométries de membranes 3D poreuses grâce aux stimuli de différenciation polymère et cellulaire dus aux charges GBN. Visant à faire un pas en avant vers l'application clinique des composites polymère/GBN, cette étude effectue une analyse comparative systématique et détaillée de l'influence des propriétés de quatre GBN différents : (i) l'oxyde de graphène obtenu à partir de procédés chimiques de graphite (GO) ; (ii) oxyde de graphène réduit (rGO) ; (iii) graphène multicouche produit par méthode d'exfoliation mécanique (Gmec) ; et (iv) du graphène faiblement oxydé via une exfoliation anodique (Ganodic) ; dispersé dans des membranes poreuses de polycaprolactone (PCL) pour induire une différenciation astrocytaire. Les membranes plates PCL/GBN ont été fabriquées par technique d'inversion de phase et largement caractérisées en termes de morphologie et de topographie, de structure chimique, d'hydrophilie, d'adsorption de protéines et de propriétés électriques. Des tests cellulaires avec des cellules de gliome C6 de rat, comme modèle pour les astrocytes spécifiques aux cellules, ont été réalisés. Remarquablement, une faible charge de GBN (0,67 % en poids) a provoqué une différence importante dans la réponse de la différenciation C6 entre les membranes PCL/GBN. Les membranes PCL/rGO et PCL/GO présentaient les marqueurs biomolécules les plus élevés pour la différenciation des astrocytes. Nos résultats ont mis en évidence les défauts structurels chimiques des nanomatériaux rGO et GO et les mécanismes d'adsorption des protéines comme la cause la plus plausible conférant des propriétés distinctives aux membranes PCL/GBN pour la promotion de la différenciation astrocytaire. Dans l’ensemble, notre étude comparative systématique fournit des conclusions généralisables et de nouvelles preuves permettant de discerner le rôle des caractéristiques des GBN pour les recherches futures sur les membranes à fibres creuses composites 3D PCL/graphène pour les modèles neuronaux in vitro.

La barrière hémato-encéphalique (BBB) est une structure dynamique et complexe de capillaires cérébraux qui contrôlent sélectivement l’homéostasie du système nerveux central (SNC) et le protègent des toxines ou des agents pathogènes1,2. Malheureusement, de nombreuses stratégies thérapeutiques prometteuses n’ont pas donné les résultats escomptés puisque la BHE représente un obstacle critique pour le traitement des maladies du SNC. Ainsi, il empêche la plupart des médicaments thérapeutiques de pénétrer dans le cerveau en raison de leurs propriétés de barrière physiques, biochimiques et spécifiques3,4.

Le développement de modèles neuronaux in vitro constitue une source de connaissances potentiellement essentielle pour la compréhension des maladies neurodégénératives et la conception de nouvelles thérapies neuroprotectrices. Ils peuvent offrir l’opportunité de planifier de nouvelles plateformes de criblage de médicaments, basées sur des cultures de cellules neurales, pour des essais cellulaires ciblés sur les troubles neurologiques. La réalisation de modèles BBB in vitro est de la plus haute importance car ils permettent de tester de manière fiable l'efficacité de nouveaux médicaments et traitements pour les troubles cérébraux. Le développement de modèles dynamiques de BBB (DIV-BBB), qui utilisent des fibres creuses de polymères commerciales comme plates-formes pour la culture de cellules endothéliales dans leur surface luminale et recréent l'environnement physiologique en termes de dynamique des fluides, a démontré une reconstruction in vitro beaucoup plus efficace de la BBB (mesurée indirectement via la résistance électrique transendothéliale (TEER)) que la méthode Transwell de référence1,5. Cependant, les modèles DIV-BBB présentent toujours des valeurs TEER bien inférieures à celles des tissus BBB natifs.

La co-culture de cellules endothéliales avec des astrocytes a été proposée comme une procédure efficace pour améliorer la reconstruction de la BHE in vitro, car il a été observé le rôle clé que jouent les astrocytes dans le développement et le fonctionnement du cerveau, ainsi que dans la régulation du phénotype des cellules endothéliales. cellules dans les modèles BBB grâce à la régulation de la communication cellule-cellule via des facteurs solubles et des interactions directes entre les astrocytes et les cellules endothéliales6. Les travaux sur les modèles DIV-BBB utilisent généralement des co-cultures de cellules endothéliales et de gliomes de rat C6 induites aux astrocytes7,8,9. Les protocoles biochimiques pour la différenciation C6 sont en quelque sorte bien standardisés et ces travaux supposent donc une différenciation astrocytaire satisfaisante. Cependant, les fibres creuses polymères commerciales utilisées pour cette application (polypropylène et difluorure de polyvinylidène principalement) présentent une mauvaise adhérence cellulaire et sont bioinertes. De plus, dans nos travaux précédents10, nous avons observé que, malgré l’utilisation de protocoles standard pour induire la différenciation des astrocytes des cellules C6 sur la surface des fibres creuses du polymère de polycaprolactone (PCL), le taux et la qualité de la différenciation étaient limités contrairement au contrôle positif des lamelles de verre.

rGO (10.8%) > Gmec (3.6%) > Ganodic (3.0%). We note that, although in principle, the oxygen content could be also evaluated from the data gathered in Table 1 by making some assumptions on the bond type (e. g., epoxy or hydroxyl), the intrinsic asymmetry of the graphitic carbon band would usually lead to an overestimation of the oxygen atomic percent. Indeed, even when the graphitic bands are fitted with an asymmetric function, as in the present work (see “Graphene-based nanomaterials synthesis and characterization” for details), part of the intensity actually coming from the tail of the graphitic signal is wrongly assigned to oxygen-containing groups. However, although the oxygen content is more accurately determined from the survey spectra (Table S1), the deconvolution data are still useful for a semi-quantitative comparison between the different materials (Table 1)./p> PCL/Ganodic > PCL/rGO > PCL/Gmec. Particularly, on PCL/Gmec membranes (Fig. 3A) there were areas where Gmec was not detected. In contrast, the rest of PCL/GBN membranes presented GBNs concentration at any point measured on the surface. It is also remarkable the low absolute intensity of the Raman spectrum of PCL/Ganodic membranes (Fig. 3B) and the presence of high intensity bands corresponding to GO throughout PCL/GO surface (Fig. 3D). Raman and FTIR spectroscopy in Fig. S2A,B, respectively, confirm the presence of characteristic bands of GBNs in the PCL membranes./p> PCL/rGO (22.3 ± 2.7%) > PCL/Ganodic (9.1 ± 0.7%) > PCL/Gmec (8.8 ± 2.7%) > PCL (4.7 ± 2.7%). Specifically, PCL, PCL/Gmec and PCL/Ganodic membranes yielded round-cell morphology (Fig. 5A–C) and 60–75% of the total cells displayed only one cellular projection (Fig. 5G). Remarkably, C6 cells cultured on PCL/Gmec (Fig. 5B) formed cell clusters that resembled multicellular spheroid-like structures as previously reported63. In contrast, PCL/rGO and PCL/GO membranes substantially stimulated the formation of two to five cell extensions, resembling the typical stellate morphology of astrocytes (Fig. 5D,E,G). Both PCL/rGO and PCL/GO membranes promoted a marked change in cell shape to an asymmetrical shape with elongated processes. Around 22% and 31% of C6 cells exhibited more than two projections on PCL/rGO and PCL/GO membranes, respectively, a proportion significantly higher than that estimated in C6 cells grown on glass coverslips (positive controls), where only 3% of cells had more than two cellular projections./p> PCL/GO (2.37 ± 0.15) > PCL/rGO (2.33 ± 0.16) > PCL/Gmec (1.34 ± 0.13). Interestingly, the expression levels in PCL/Ganodic, PCL/GO and PCL/rGO membranes were significantly higher in comparison with the level in PCL membranes normalized to 1 (Fig. 5H). Regarding Slc1a3 (Glast) expression, only C6 cells grown on PCL/rGO (1.66 ± 0.31) and PCL/GO (2.97 ± 0.06) membranes showed significantly increased levels when compared with C6 cells cultured on PCL membranes (Fig. 5H). Finally, Fig. 5I presents the Western blotting of cell lysates, revealing a relative 1.6-times increase in nestin protein expression in C6 cells cultured on PCL/rGO and PCL/GO membranes compared to PCL./p> 99.8%, Honeywell) solutions and UV light, and washed with sterile PBS to remove EtOH traces, all in a laminar flow cabinet./p>